慢性肾脏病的尿液蛋白质组学及升清降浊胶囊的作用机制研究

【摘要】目的：慢性肾脏疾病(chronickidenydisease,CKD)是一个全球性的医学问题,近年来CKD的发病率明显升高,严重威胁着人类的健康与生命。早期发现、早期诊断能够提高该病的治疗效果,从而减轻个人和社会的负担。因此,积极寻找CKD的早期标志物,有助于阐明CKD发病机制,提高诊断和疗效,也有助于寻找新药的作用靶点。CKD的病因包括肾小球疾病、肾小管间质疾病、肾血管疾病、代谢性疾病和结缔组织疾病性肾损害、感染性肾损害及先天性和遗传性肾脏疾病等。在我国,CKD患病率约为9%～14%,病因以原发性慢性肾小球肾炎最为多见。CKD进展至中后期(CKD3-5期),肾功能中重度受损,肾脏排泄、分泌及调节等功能逐渐丧失,导致水电解质紊乱,酸碱平衡失调,氮质代谢产物和毒素潴留等症状。CKD3-5期属于中医学“虚劳”、“水肿”、“癃闭”、“关格”等范畴。升清降浊胶囊是我科名老中医洪钦国教授针对CKD3-5期中医基本病机——脾肾亏虚,浊毒瘀阻而创立的有效制剂。本研究以原发病为原发性肾小球肾炎的CKD3-5期(非透析)患者为研究对象,观察升清降浊胶囊对CKD3-5期患者的肾功能、钙磷代谢、营养状态、血脂水平及中医症候的改善情况,探讨升清降浊胶囊的疗效机制。尿液检查由于其样本收集的无创性在临床疾病的诊断中扮演了重要的角色。尿液蛋白质组学已经被广泛用于探究肾脏疾病的发病过程。本研究利用尿液蛋白质组学技术寻找CKD早期诊断及监测疾病进展的蛋白标志物,进一步探明CKD的发病和进展机制。同时,通过分析升清降浊胶囊治疗CKD3期、CKD4-5期前后的差异蛋白,筛选升清降浊胶囊的药物靶点蛋白,探讨其作用机制。方法：1.临床研究共纳入79例CKD3-5期(非透析)患者,其中CKD3期40例,CKD4期19例,CKD5期20例。三组患者在给予低蛋白饮食、控制血压、纠正水电和酸碱平衡等基本治疗的基础上加服升清降浊胶囊,治疗12周后,分析三组患者治疗前后的中医症状、中医证候积分及实验室指标(血肌酐、血尿素氮、肾小球滤过率、白蛋白、胆固醇、甘油三酯、血红蛋白、血钙、血磷、钙磷乘积和尿酸)的情况。2.实验研究共纳入CKD1-5期(非透析)患者40例,其中CKD1期、CKD2期、CKD3期、CKD4-5期各10例(CKD3期和CKD4-5期从临床试验患者中随机抽取,接受过升清降浊胶囊12周的治疗),收集同期来自体检中心的健康志愿者10例。采集各组及CKD3期、CKD4-5期升清降浊胶囊治疗后的新鲜中段尿,将每组10例尿液进行组内混合。利用iTRAQ标记联合二维液相色谱串联质谱(2DLC-MS/MS)技术进行定量的尿液蛋白质组学研究,具体步骤包括：蛋白质提取、去除高丰度蛋白、蛋白质纯化、蛋白质浓度测定、SDS-PAGE、蛋白质酶解、iTRAQ标记、二维液相色谱与串联质谱。最后,以质谱文件为原始文件,利用Mascot软件在IPI(InternationalProteinIndex)的数据库中进行肽段信息搜索,根据iTRAQ标记定量的蛋白质相对丰度来寻找差异蛋白质,并进行蛋白质功能分析。结果：1、临床研究：(1)一般资料分析：CKD3期组患者中男23例,女17例,年龄分布29-65岁,平均年龄为(43.93士9.20)岁；CKD4期组患者中男10例,女9例,年龄分布24岁-68岁,平均年龄为(48.95士14.68)岁；CKD5期组患者中男7例,女13例,年龄分布28-70岁,平均年龄为(55.95士13.40)岁。三组患者平均年龄有明显差异(P<0.01),随着CKD病情的进展,患者的平均年龄逐渐增高,其中CKD5期组患者平均年龄明显高于CKD3期组(P<0.01)。三组患者性别分布差异无统计学意义(P>0.05)。(2)中医证候疗效：三组治疗后主要中医临床症状较治疗前均有明显改善；中医证候积分较治疗前均有明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)；中医证候疗效显著,其中CKD3组中医症候疗效：显效10例,有效30例,无效0例,总有效率100%；CKD4期组中医症候疗效：显效5例,有效14例,无效0例,总有效率100%；CKD5期组中医症候疗效：显效4例,有效14例,无效2例,总有效率90%。三组间中医症候疗效无明显差异(P>0.05)。(3)实验室指标：三组治疗后Scr较治疗前均有显著降低(P<0.05或P<0.01),此外,CKD4期组、CKD5期组Scr降低的疗效优于CKD3期组(P<0.05),CKD4期组和CKD5期组之间无明显差异。三组治疗后eGFR较治疗前均有显著升高(P<0.05或P<0.01),但eGFR升高的水平在三组组间无明显差异(P>0.05)。三组治疗前后BUN、ALB、CHOL、TG的无明显差异(P>0.05)。治疗后CKD5期组HGB较治疗前明显增高(P<0.05),CKD3期和CKD4期治疗前后HGB差异无统计学意义(P>0.05)。三组治疗后Ca较治疗前均有升高,P、钙磷乘积、UA较治疗前均有降低,但差异均无统计学意义(P>0.05)。2.实验研究(1)本研究共鉴定出1576个蛋白,其中与CKD疾病相关的差异蛋白有144个,在各组CKD患者中21个蛋白同时上调,123个蛋白同时下调。对差异蛋白进行蛋白功能分析显示,其分子功能主要为：结合功能、催化活性、受体活性；参与的生物过程主要为：单生物过程、细胞过程、生物学调控、调控生物过程；其细胞位置主要位于细胞、膜、胞外区。(2)本研究筛选出8个可能成为CKD早期诊断标志物的差异蛋白,其中1个蛋白在CKD1-5期均明显高表达,可能是疾病的致病因素或产物；7个蛋白在CKDl-5期均明显低表达,这类蛋白可能是机体的保护因素或机制,在疾病过程中明显下调。对差异蛋白进行蛋白功能分析显示,其分子功能主要为：结合功能和催化活性；参与的生物过程主要为：调控生物过程和信号通路；其细胞位置主要位于胞外区。(3)本研究筛选出与17个与CKD病情进展相关的差异蛋白。随着CKD病情由CKD1期向CKD4-5进展,其中2个蛋白在CKD各组依次逐步上调,15个蛋白在CKD各组依次逐步下调。这类差异蛋白,可能成为监测CKD病情进展、预后及药物疗效的蛋白标志物。对差异蛋白进行蛋白功能分析显示,其分子功能主要为：结合功能、酶活性和受体活性；参与的生物过程主要为：代谢过程、调控生物过程、细胞过程和信号通路；其细胞位置主要位于细胞膜、细胞器和胞外区。(4)本研究筛选出6个可能的升清降浊胶囊治疗CKD的药物靶点蛋白。其中1个蛋白在CKD各期表达上调,另5个蛋白在CKD各期表达下调,升清降浊胶囊治疗后均可以使原来上调／下调的表达发生相对应的改变。对差异蛋白进行蛋白功能分析显示,其分子功能主要为：结合功能、酶活性和细胞因子活性；参与的生物过程主要为：代谢过程、调控生物过程；其细胞位置主要位于细胞器和胞外区。结论：1.临床研究临床研究结果表明升清降浊胶囊可以明显改善CKD3-5期(非透析)患者的肾功能,能够降低其血肌酐,使e-GFR升高；可以明显改善中医临床症状,降低中医症候积分,显著的提高中医证候疗效(总有效率在90-100%),从而达到保护残余肾功能,延缓CKD的进展的作用。2.实验研究(1)本研究应用iTRAQ标记联合二维液相色谱串联质谱(2DLC-MS/MS)技术,建立了健康人、CKD不同临床分期患者的尿液蛋白质组表达谱,以及升清降浊胶囊治疗后的CKD3期和CKD4-5期的尿液蛋白质组表达谱。(2)本研究鉴定到健康人与各期CKD患者间均存在大量的尿液差异蛋白,并从中筛选出可能的CKD早期诊断标志物、监测疾病进展和预后的蛋白标志物,对这类蛋白的功能进一步研究,有利于我们发现CKD疾病的发病机制及进展机制,从而为CKD的早期诊断、早期治疗和延缓进展提供依据。(3)本研究在临床研究证实升清降浊胶囊治疗CKD3-5期有效的基础上,成功的筛选出可能的升清降浊胶囊治疗CKD的药物靶点蛋白。对这些蛋白的进一步分析和研究,有助于我们探明升清降浊胶囊的作用机制,也有助于我们从蛋白组学水平来阐明CKD的中医病机实质,从而推动中药现代化的发展。
【作者】王超；
【导师】汤水福；
【作者基本信息】广州中医药大学，中医内科学（专业学位），2014，博士
【关键词】慢性肾脏病；尿液蛋白质组学；发病机制；升清降浊胶囊；药物作用靶点；

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